HPV高危16型对医用消毒剂的敏感性分析

目的

消毒剂对HPV的杀灭效果如何，到目前为止，我们知之甚少。HPV可能是人类性接触传播的病菌中最常见的病菌。HPV感染是宫颈癌和肛门癌的主要原因，同时也是口咽部癌症的原凶之一。除了性传播，垂直传播和非性接触传播也是HPV的重要传播方式。

方法

用人工合成的HPV16准病毒颗粒和真正的从人上皮细胞组织中培养出来的HPV病毒进行实验，我们用消毒剂对HPV进行了杀灭测试，以了解消毒剂对HPV的杀灭效果。有致病力的病毒株置于11种待测试的消毒剂中一段时间后往消毒剂中加入中和剂中止消毒剂的消毒作用，然后离心过滤。检测被消毒剂处理过的病毒的滴度，与未被处理过的病毒的滴度进行对比。

结果

HPV16型对消毒剂有非常高的抵抗力，其对消毒剂的抵抗力比之前测试的大部分无胞膜病毒对消毒剂的抵抗力还强。准病毒颗粒对消毒剂的抵抗力与真实病毒颗粒对消毒剂的抵抗力一样高，但准病毒颗粒对异丙醇、苯酚和过氧乙酸复合银离子等消毒剂敏感，真实病毒和准病毒均对戊二醛和邻苯二甲醛不敏感，但都对次氯酸盐和高浓度过氧乙酸复合银离子敏感。

结论

我们首次对HPV16天然病毒进行了消毒剂敏感性研究，结果显示这些临床常用的消毒剂（甚至灭菌剂）对HPV16型病毒的杀灭效果不理想，这些消毒剂常用于医疗机构和牙科诊所的医疗器材的消毒（灭菌）。我们需要政策指引如何使用合适的消毒剂杀灭HPV。因HPV16型对消毒剂有超常的抵抗力，所以这一点可能可以解释为什么污染物对环境的污染可能会导致HPV的传播和通过非性接触传播。

介绍

因HPV生长周期的特殊性，一直以来，很难在实验室中对培育出具有感染性的HPV并用于实验，直至近期才解决这个问题。在动物体外进行培育具有感染性HPV的技术对基础研究非常有益。我们需要的是省时省力省钱的方法。

HPV的生命周期与已分化的上皮组织密切相关。一直以来，因为很难在体外培育出具有高滴度的有感染性的HPV病毒，所以无法在体外对HPV进行消毒剂敏感性检测，所以我们不了解消毒剂对HPV的消毒效果。人类已经对很多病毒进行了消毒剂的杀灭检测，这些检测结果给了医疗机构相关的信息，对控制医疗相关感染、控制病毒的传播和控制再感染起了很大的作用。目前，医院和医疗研究部门使用消毒剂对HPV进行杀灭，缺乏相关的资料，只是从消毒剂可杀灭其它的病毒来选择，或者只是想当然认为消毒剂对HPV有效就使用。现在培育有两种系统方法可培育足量的HPV病毒用于科研，一种是利用人工重组合成，另一种方法是在体外进行器官培育。现在可通过逆转录定量PCR的方法对有感染性的病毒进行滴度检测。因HPV导致的癌症，有60%是由HPV16型所引起的，所以最初进行的HPV相关的实验对象就是HPV16型。

通过病毒样颗粒技术、准病毒技术和器官培育病毒三大技术，可以得到实验用的高浓度HPV。有了这些技术支持，我们成功的进行了第一个关于常用消毒剂对HPV16的消毒效果的实验，结果显示这些消毒剂甚至是灭菌剂，对HPV16的消毒效果并不理想。HPV16型对消毒剂有非常高的抵抗力，其对消毒剂的抵抗力比之前测试的大部分无胞膜病毒对消毒剂的抵抗力还强。我们需要政策指引如何使用合适的消毒剂杀灭HPV。因HPV16型对消毒剂有超常的抵抗力，所以这一点可能可以解释为什么污染物对环境的污染可能会导致HPV的传播和通过非性接触传播。

方法

器官培育病毒

从新生儿包皮环切组织标分离出包皮角质形成细胞(HFKs)，这个实验所用的HFKs得到两个部门的认可，一是宾夕法尼亚州立大学医学院审查委员会，另一个部门是Pinnacle健康医院机构审查委员会。丢弃的、未识别的组织无需患者知情同意。两个机构审查委员会都放弃了知情同意。将全长HPV16电穿孔至低传代HFK单层培养，选择稳定维持HPV16基因组的角质形成细胞系进行有机型培养。将被HPV16感染的HFK细胞接种于含有J2和3T3细胞的鼠尾型-1胶原基质。在上皮细胞生长至融合后，这些基质被转移到不锈钢网格上建立液-气界面。然后用扩散法继续培养接种物。培养的上皮细胞被分化，然后收获，收集组织并储存进行病毒颗粒分离。

准病毒

用Buck等人所述方法产生准病毒。293TT细胞系，已知表达高水平SV40大T抗原，与遗传密码修饰的HPV16衣壳基因L1和L2共转染HPV16。HPV16衣壳基因质粒含有SV40来源的复制进行表达。48 小时后，取细胞进行病毒颗粒分离。

病毒颗粒分离

取0.6 mL冰凉1 M NaCl/0.05 M 磷酸钠缓冲液，用7.5 mL匀浆机匀浆培养组织和293TT细胞。用1 M NaCl/0.05 M n磷酸钠缓冲液200 mL, pH 8，均匀洗涤2次。溶液在4摄氏度用10500转/分的转速离心10min，上清液转入1.8 mL Nalgene冷冻瓶。原始病毒储存在-20摄氏度。

消毒测试

此消毒剂测试中所用的消毒剂有乙醇（(Fisher Scientific)）、异丙醇（Sigma–Aldrich）、戊二醛（强生）、邻苯二甲醛（强生）、苯酚（CiDecon; Decon Labs）、过氧乙酸复合银离子（STERIPLEX SD and STERIPLEX SD Pluss;sBioMed）和次氯酸盐（Activate; Deardorff Fitzsimmons Corp）。

按厂家说明书准备消毒剂，使用前按要求稀释，具体浓度见表1。室温下把病毒与消毒剂混合，作用45分钟后加入合适的中和剂中止消毒剂的消毒作用。醛类消毒剂所用的中和剂是7%的甘氨酸；过氧乙酸复合银离子消毒剂的中和剂是0.1%吐温80、1%蛋白胨、1%半胱氨酸和0.5M氨丁三醇缓冲剂，pH7.5；其它的消毒剂所用中和剂与过氧乙酸所用中和剂相同。溶液在超滤膜离心机中以4000离心10分钟，超滤膜的分子量设定为10000。然后再加入中和剂再以同样转速再一次离10分钟。在HaCaT培养基中加入加入两份冲洗液。检测液中含有已经处理的有感染性的病毒。

表1 各种消毒剂作用45分钟对HPV的杀灭效果

实验重复5次取平均值

结果

表1所示为实验所用消毒剂。酒精入选的原因是因为在日常生活及医疗环境下，酒精常用于手部消毒及环境消毒，使用广泛。有研究显示生殖系统感染了HPV的病人手指上有高浓度HPV，我们想了解酒精对HPV是否有效以便确定能否用于此类感染者。戊二醛做为高水平消毒剂和灭菌剂在医疗机构和牙科诊所使用广泛而入选，邻苯二甲醛做为高水平消毒剂入选。其它消毒剂也因为其广泛使用而入选。

只有0.525%次氯酸盐和1.2%过氧乙酸银离子对原始病毒有效，其降低的对数值分别为4.862和5.150，杀灭率大于99.99%。其它消毒剂则完全无杀灭作用，详见表1。

对比两种不同方法得到的原始病毒，器官培育法耗时耗力费用高，而重组方法得到原始病毒的方法更省时省力省费用，然而，在器官培育中培育出来的病毒，组织的分化伴随而来在层状组织中发生的生理条件与通常被HPV16感染的粘膜中发现的情况更为相似。我们试图研究HPV16准病毒与HPV16原始病毒在消毒剂敏感性方面是否存在差异。实验结果显示准病毒对消毒剂的敏感性要高于原始病毒，异丙醇对原始病毒无效，但却对准病毒有效。有趣的是，戊二醛和邻苯二甲醛对病毒均无杀灭作用。我们把戊二醛的作用时间延长到48小时，依然没有杀灭作用（未附上数据）。醛类的消毒机制之一是病毒衣壳蛋白中重要赖氨酸残基的交联。这些衣壳修饰的下游效应可能包括抑制病毒进入病毒基因组的脱壳和运输到正确的细胞间隔，这是启动病毒程序所必需的。醛类也能有效地使核酸变性，这表明如果病毒衣壳的完整性受到损害，病毒DNA或RNA也可能被灭活。Knappe等人发现L1衣壳蛋白中存在赖氨酸残基，对高效感染具有重要意义。牛乳头瘤病毒的结构数据也表明，赖氨酸残基位于L1蛋白的入侵臂上，这可能对五聚体的完整性很重要。虽然准病毒粒子和来自器官培育的病毒对某些消毒剂的敏感性不同，但它们对醛类的共同抗性导致了这样一种假设，即这些残留物要么不可接近，要么没有表现出交联所需的适当空间分离。这一共性表明这两种病毒粒子在结构上有一些相似之处。对这两种病毒颗粒类型都有效的消毒剂是1.2%的过氧乙酸银离子和次氯酸盐，这两种消毒剂剂都是强氧化剂，表明以氧化为基础的消毒剂可能对灭活HPV有效。

在使用戊二醛和邻苯二甲醛时，经常会延长作用时间，所以我们把这两种消毒剂的作用时间延长到24小时，以观察对原始病毒的杀灭效果。结果显示延长作用时间，依然对HPV无效。

对中和剂也进行了检测，对病毒无杀灭作用，证明中和剂的选择是正确的。表1与图1的检测均进行5次然后取平均值，表2的检测进行了6次然后取平均值。由于这些结果对于医院获得性感染和医源性获得性感染的重要性，所有的研究都是由不同的研究人员在两个地点进行的，使用了多批病毒和细胞。

讨论

到目前为止，这是第一个被证实的对戊二醛灭活抵抗的病毒。由于戊二醛对其他微生物病原体的杀灭作用范围广，在许多临床情况下都是首选的消毒剂。它已被证明对包括腺病毒、细小病毒、杯状病毒和许多肠病毒在内的多数无包膜病毒有效。除了对戊二醛和邻苯二甲醛的耐药外，HPV16与其他高度耐药的无包膜病毒如杯状病毒和细小病毒有许多相似之处。这些病毒都对高浓度次氯酸盐较为敏感，在一项研究中，细小病毒对过氧乙酸-银离子消毒剂以及过氧乙酸也都敏感。一般来说，无包膜病毒对酒精类消毒剂都有中度或完全的抵抗性，在这个研究中，HPV16也确实对酒精高度抵抗。

有研究表明，HPV存在非性传播途径。有研究评估了婴儿与母亲在HPV方面的一致性，结果发现在HPV检测阳性的母亲群体，有小比率的婴儿HPV检测也阳性。有趣的是，有两个婴儿HPV检测阳性，但其母亲HPV检测却是阴性。为了提高检测结果的可靠性，避免实验过程中出现的污染，在婴儿出生时即采样并且在独立的实验室进行PCR检测。这些发现表明，在临床环境中确实存在感染HPV的风险。结合我们的消毒剂实验数据，可以想象，目前使用的许多消毒剂可能无法有效消除医院感染中的HPV。对没有性生活史的女性的患病率进行了研究，发现了不同的结果。Kjaer等人对一组处女进行了为期2年的跟踪研究，在研究开始时，所有处女的VLP HPV16均为DNA阴性，血清学检测也为阴性。只有那些在研究过程中开始的性生活的女性被发现具有可检测到的HPV16 DNA和/或血清转化。Tay et al. 15通过阴道镜和组织学检查确定了HPV感染的发生，发现在他们的研究中，50%的处女阴道镜下有HPV感染的证据，同时对这50%的群体进行组织学检查确诊，80%有HPV感染。

这些研究中发现的差异可能是由于检测方法、样本量、地理位置甚至患者转诊过程的不同造成的。这些方法和设计上的变化是常见的，通常会导致无法解释HPV感染的自然史方面的结论。我们的数据支持了HPV感染相关传播、自体接种和医院传播的可能性，即使是被认为是“无菌”的仪器设备，也存在HPV污染的风险。由于天然HPV16已被证明对化学消毒剂具有很强的抵抗性，特别是对手消毒剂和仪器消毒经常使用的消毒剂，因此有必要制定新的感染控制措施已应对HPV导致的感染风险。常规消毒和卫生可能不足以清除HPV的可能来源，因此在感染活动性病毒的人群中，再次感染的风险可能会增加。此外，我们的数据显示，准病毒粒子和类似粒子可能无法准确测量消毒剂对HPV的有效性。

本文属 “伽玛卫生消毒专家”  原创翻译，转载请注明出处及二维码